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引言
γH2AX 是染色體組蛋白H2A家族的成員之一。在各種理化因素刺激下，細胞DNA雙鏈發生斷裂，ATM、ATR等磷脂酰肌醇3-激酶使H2AX上的第139位絲氨酸發生磷酸化修飾，形成磷酸化的γH2AX 。γH2AX作為一種生物標志物可以清楚地反映DNA損傷程度和修復情況, 被國內外廣泛應用于細胞凋亡研究中, 是細胞損傷應激反應的研究熱點之一。常見的γH2AX鑒定分析方法包括免疫發光法和質譜法，但因復雜預處理過程會假陽性。因此原位實時檢測細胞核內γH2AX對于準確評估遺傳毒性至關重要。SERS技術具備原位、無損、預處理簡單、高靈敏度等優勢，有望用于γH2AX原位分析。但是，SERS檢測細胞核內物質仍面臨巨大挑戰。SERS增強效果與粗糙金屬尺寸相關，顆粒直徑越大，振蕩頻率和增強效果越好。進入細胞核內需要穿過核孔，其限制直徑尺寸為10-30nm，粗糙金屬顆粒尺寸小導致SERS增強效果弱。在現有技術中，主要通過修改核定位序列實現主動運輸至細胞核來實現核內檢測，該技術提高了進核效率，卻因基質存在而產生背景干擾。
在本文中，南京師范大學王琛教授課題組構建了一種基于金納米粒子（GNPs）的小型免疫傳感器SERS探針，成功檢測受限靶點γH2AX，評估藥物遺傳毒性。作者利用γH2AX作為限制靶點的特性，構建了一種基于小尺寸（15nm）金納米探針的γH2AX免疫傳感器，并用TAT核靶向肽對其進行了修飾，以確保高的核進入效率。一旦DNA損傷被誘導，γH2AX的局部過表達通過免疫識別進一步募集探針，從而可以原位組裝熱點，將增強拉曼信號用于遺傳毒性檢測。本研究提出了一種研究提出了一種新的SERS檢測受限靶誘導的尺寸轉換和熱點形成的方法，用于分析核內遺傳毒性標志物。該技術的優點在于簡化了SERS探針的結構和操作過程，避免了對含有熱點的系統的額外設計，從而減少了背景信號，從而為在單個活細胞水平上原位實時檢測核內靶標提供了參考。
作者利用γH2AX作為限制靶點的特性，構建了一種基于小尺寸（15nm）金納米探針的γH2AX免疫傳感器，探針以4-巰基芐腈（4-MBN）修飾的15nm GNPs為增強顆粒，PEG2000為穩定鏈，TAT為穿透肽，γH2AX單克隆抗體為探測識別物，建立為抗-γH2AX@GPMT的SERS傳感器。
實驗時通過TAT穿透肽的小顆粒和核靶向功能進入細胞核，將構建的SERS細胞傳感器與藥物一起孵育。若藥物沒有遺傳毒性探針以分散狀態分布，拉曼信號弱。相反，如果藥物具有遺傳毒性發生DNA損傷，產生γH2AX的局部表達，誘導探針進一步免疫識別和聚集，在原位構建增強熱點，產生高強度拉曼信號實現遺傳毒性鑒定。
本研究以γH2AX為細胞核內定向靶點，突破了SERS探針進入細胞核效率和信號增強因子之間的局限性。構建了一種基于GNP探針的γH2AX免疫傳感器來評估藥物遺傳毒性。該傳感器具備TAT膜穿透性和核靶向功能，使小顆粒探針能夠穿過核孔并成功進入細胞核。該探針進入細胞核內后，GTIs誘導DNA損傷和γH2AX局部過表達，導致原位構建增強熱點并產生強拉曼信號，進一步增強了探針的免疫識別性能，解決了小探針增強性能差和大探針入核效率差的矛盾難題。本文所設計SERS探針可原位分析細胞核內遺傳毒性，為藥物遺傳毒性篩選提供了一種新方法，也為細胞核內原位實時檢測提供了實驗靈感。
王琛，南京師范大學化學與材料科學學院教授，博士生導師，國家優秀青年科學基金獲得者（2020年），江蘇省“青藍工程"優秀青年骨干教師、中青年學術帶頭人；南京師范大學本科、碩士，2011年博士畢業于南京大學化學化工學院生命分析國家重點實驗室，2012-2016南京大學從事物理學博士后，2016-2017年麻省理工學院（MIT，美國）訪問學者。至今，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等學術期刊發表研究論文60 余篇；參編英文圖書 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley)；主持多項國家自然科學基金、江蘇省重點研發、江蘇省自然科學基金等項目；擔任Chinese Chemical Letters期刊編委，中國分析測試協會青年學術委員會委員，江蘇省材料學會副秘書長。
本文以“Confined Target-Triggered Hot Spots for In Situ SERS Analysis of Intranuclear Genotoxic Markers"為題發表在Analytical Chemistry上，中國藥科大學韓凌飛為第一作者，南京師范大學王琛教授和中國藥科大學柳文媛教授為通訊作者。
本研究采用的是北京卓立漢光儀器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，如需了解該產品，歡迎咨詢。
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